Mode of action of a novel killertoxin

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Description

Im Killertoxin der Hefe Pichia acaciae (vom linearen Plasmid pPac1-2 kodiert) ist ein bisher unbekanntes, die Zielzelle schädigendes Prinzip verwirklicht. Das Toxin gelangt nach Bindung an seinen Zellwandrezeptor (Chitin) ins Innere der Zelle und löst dort eine Reaktion aus, die frappierende Ähnlichkeit mit derjenigen auf DNA-schädigende Agenzien aufweist. Im Verlaufe der zellulären Antwort auf das Toxin kommt es nämlich zur Auslösung des DNA-damage-checkpoints und zum Zellzyklusarrest in der S-Phase. Darüber hinaus zeigen Toxin-behandelte Zellen erhöhte Mutationsraten und nach fortdauerndem Kontakt erfolgt apoptotischer Zelltod. In den hier beantragten Arbeiten soll der Mechanismus der DNA-Schädigung aufgeklärt und die Grundlagen der Plasmid-vermittelten Toxinimmunität untersucht werden. Die intrazellulär aktive Untereinheit des Toxins soll nach heterologer Expression aufgereinigt und ihre Funktion in vitro analysiert werden. Ein mit Hilfe des isolierten Proteins generierter Antikörper soll zur subzellulären Lokalisation des Proteins sowie zum Nachweis von DNA-Bindung in vivo mittels Chromatin-Immunopräzipitation verwendet werden. Eine Analyse der Reaktion von Saccharomyces cerevisiae Mutanten mit definierten Defekten in verschiedenen DNA-Reparaturwegen soll klären, auf welche Weise die Zelle der Toxinschädigung entgegen zu wirken versucht und somit das Bild des Toxinwirkungsmechanismus vervollständigen. Die Arbeiten zur Toxinimmunität umfassen die Identifikation des Resistenz-vermittelnden Gens, dessen heterologe Expression und die Charakterisierung der Wirkung.